恒溫培養(yǎng)箱應(yīng)用于大腸桿菌細(xì)胞的制備實(shí)驗(yàn)

     電熱恒溫培養(yǎng)箱采用電熱膜加熱方式，在箱體與內(nèi)膽之間安裝電熱膜，使用熱傳遞方式加熱，加熱速度快。多應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室的各種細(xì)胞菌類的培養(yǎng)，今天要說的是大腸桿菌，下面喆圖小編講一些操作流程供大家參考一下。

     細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法（電擊法、CaCl2法）等處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變，成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的細(xì)胞，即感受態(tài)細(xì)胞（Compenent cells）。

實(shí)驗(yàn)方法原理：

     帶有外源DNA 的重組質(zhì)粒，在體外構(gòu)建后，導(dǎo)入宿主細(xì)胞，隨著細(xì)胞的大量復(fù)制、繁殖，才能夠有機(jī)會(huì)獲得純的重組質(zhì)粒DNA，該過程稱之為轉(zhuǎn)化過程。受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化學(xué)試劑）的處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，能容許外源DNA 的載體分子通過。

實(shí)驗(yàn)材料：

E. coli DH5α菌株

試劑、試劑盒：LB固體培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基、CaCl2、硫酸鎂、SOB、TFB

儀器、耗材：培養(yǎng)皿、恒溫?fù)u床、聚丙烯管、電熱恒溫培養(yǎng)箱、臺(tái)式高速離心機(jī)、無菌工作臺(tái)、燒瓶、恒溫水浴鍋、低溫冰箱、制冰機(jī)、分光光度計(jì)、微量移液槍、錐形瓶、試管

實(shí)驗(yàn)步驟：

1、從37℃培養(yǎng)16-20 h的平板中挑取一個(gè)單菌落(直徑2-3 mm)，轉(zhuǎn)到一個(gè)含有100 ml LB或SOB培養(yǎng)基的1L燒瓶中。于37℃劇烈振搖培養(yǎng)3 h。一般經(jīng)驗(yàn)，1 OD600約含有大腸桿菌DH5α 109 個(gè)/mL。

2、將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè)無菌、一次性使用的、用冰預(yù)冷的50 ml聚丙烯管中，在冰上放置10 min，培養(yǎng)物冷卻至0℃。

3、于4℃用Sorvall GS3特頭（或與之相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)頭）以4 100 r/min離心10 min，以回收細(xì)胞。

4、倒出培養(yǎng)液，將管倒置1 min以使后的痕量培養(yǎng)液流盡。

5、每50 ml初始培養(yǎng)液用30 ml預(yù)冷的0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80 mmol/L MgCl2，20 mmol/L CaCl2)重懸每份細(xì)胞沉淀。

6、于4℃用Sorvall GS3轉(zhuǎn)頭（或與之相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)頭）以41 00 r/min離心10 min，以回收細(xì)胞。

7、倒出培養(yǎng)液，將管倒置1min以使后的痕量培養(yǎng)液流盡。

8、每50ml初始培養(yǎng)物用2ml用冰預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2(或TFB)重懸每份細(xì)胞沉淀。

9、此時(shí)，可以用新鮮制備的感受態(tài)細(xì)胞直接做轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，也可以將細(xì)胞凍存于-70℃。

注意事項(xiàng)：

1.為達(dá)到轉(zhuǎn)化，活細(xì)胞數(shù)務(wù)必少于108個(gè)細(xì)胞/mL，對(duì)于大多散大腸桿菌來說，這相當(dāng)于OD值為0.4左右。為保證細(xì)菌培養(yǎng)物的生長(zhǎng)密度不致過高，可每隔15-20min測(cè)定OD600值來監(jiān)測(cè)，用監(jiān)測(cè)的時(shí)間及OD值列一個(gè)圖表，以便預(yù)測(cè)培養(yǎng)物的OD600值到0.4的時(shí) 間，當(dāng)OD600值達(dá)到0.35時(shí)，收獲細(xì)菌培養(yǎng)物。

2.在菌株與菌株之間，OD值與每毫升中活細(xì)胞散間的關(guān)系變化很大，因此有必要通過漶量特定腦桿菌的生長(zhǎng)培養(yǎng)物在生長(zhǎng)周期的不同時(shí)相的OD600值，并將各稀釋維度的培養(yǎng)物鋪于無抗生素的LB瓊脂板以計(jì)算每一時(shí)相的活細(xì)胞散，從而使分光光度計(jì)讀數(shù)得到標(biāo)準(zhǔn)化。

3.對(duì)大多數(shù)大腸桿菌（MC106除外），采用TFB代替CaCl2可得到相同或更好的結(jié)果。Dagert和Ehrlieh的實(shí)驗(yàn)(1979)曾表明，細(xì)胞可以于4℃在CaCl2溶液中保存24-48 h，在貯存的初12-24 h內(nèi)，轉(zhuǎn)化率增加4-6倍，然后降低到初始水平。

4.克隆的新鮮程度，一定要選新鮮平板的單克隆，即剛涂布生長(zhǎng)過夜的平板。

5.菌體的OD600值，JM109或BL21，OD值為0.35，DH5α為0.4，要盡量保證OD值不要過高，更不能超過0.6。

6.低溫處理的時(shí)間，做完后冰上保存12-24h后分裝，并保存于-80℃。

7.試劑和用品，所有的用品（離心管、藥瓶等）用新的，如果使用舊的，要確保干凈，CaCl2溶液。