細菌回復突變試驗

      1、范圍：適用于化妝品原料及其產(chǎn)品的基因突變檢測。

      2  定義

      2.1 回復突變 reverse mutation

細菌在化學致突變物作用下由營養(yǎng)缺陷型回變到原養(yǎng)型(prototroph)。

      2.2 基因突變 gene mutation

在化學致突變物作用下細胞DNA中堿基對的排列順序發(fā)生變化。

      2.3 堿基置換突變 base substitution mutation

引起DNA鏈上一個或幾個堿基對的置換。

堿基置換有轉(zhuǎn)換(transition)和顛換(transversion)兩種形式。

轉(zhuǎn)換是DNA鏈上的一個嘧啶被另一嘧啶所替代，或一個嘌呤被另一嘌呤所代替。

顛換是DNA鏈上的一個嘧啶被另一嘌呤所替代，或一個嘌呤被另一嘧啶所代替。

      2.4 移碼突變 frameshift mutation

引起DNA鏈上增加或缺失一個或多個堿基對。

      2.5 細菌回復突變試驗bacterial reverse mutation assay

利用一組組氨酸或者色氨酸缺陷型試驗菌株測定引起細菌堿基置換或移碼突變的化學物質(zhì)所誘發(fā)的氨基酸缺陷型→原養(yǎng)型回復突變的試驗方法。

      2.6 S9

經(jīng)多氯聯(lián)苯(PCB混合物)或C12H12N2O3鈉和β-萘黃酮結(jié)合誘導的大鼠制備肝勻漿，在9000g下離心10min后的肝勻漿上清液。

      3  原理

鼠傷寒沙門氏組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株不能合成組氨酸，故在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上，僅少數(shù)自發(fā)回復突變的細菌生長；大腸桿菌色氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株不能合成色氨酸，故在缺乏色氨酸的培養(yǎng)基上，僅少數(shù)自發(fā)回復突變的細菌生長。假如有致突變物存在，則營養(yǎng)缺陷型的細菌回復突變成原養(yǎng)型，因而能生長形成菌落，據(jù)此判斷受試物是否為致突變物。

某些致突變物需要代謝活化后才能引起回復突變，故需加入經(jīng)誘導劑誘導的大鼠肝制備的S9混合液。

      4  儀器和設(shè)備

電熱恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴、振蕩水浴搖床、壓力蒸汽消毒器、干熱烤箱、低溫冰箱（－80℃）或液氮生物容器、普通冰箱、天平(精密度0.1g和0.0001g)、混勻振蕩器、勻漿器、菌落計數(shù)器、低溫高速離心機，玻璃器皿、生物安全柜等。

      5  培養(yǎng)基和試劑

      5.1 0.5mmol/L組氨酸－0.5mmol/L色氨酸－0.5mmol/L生物素溶液

配制：將上述成分加熱，以溶解生物素，然后在0.068MPa下高壓滅菌20min。貯于4℃冰箱。若試驗中不使用大腸桿菌，則不添加色氨酸。

      5.2 頂層瓊脂培養(yǎng)基

配制：上述成分混合后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。實驗時，加入0.5mmol/L組氨酸－0.5mmol/L色氨酸－0.5mmol/L生物素溶液20mL。若試驗中不使用大腸桿菌，則不添加色氨酸。

      5.3 Vogel-Bonner(V-B)培養(yǎng)基E

配制：先將前三種成分加熱溶解后，再將溶解的硫酸鎂緩緩倒入容量瓶中，加蒸餾水/去離子水至1000mL。于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲于4℃冰箱。

      5.4 20%葡萄糖溶液

配制：加少量蒸餾水/去離子水加溫溶解葡萄糖，再加蒸餾水/去離子水至1000mL。于0.068MPa下高壓滅菌20min。儲于4℃冰箱。

      5.5 底層瓊脂培養(yǎng)基

配制：首先將前兩種成分于0.103MPa下高壓滅菌30min后，再加入后兩種成分，充分混勻倒底層平板。按每皿25mL制備平板，冷凝固化后倒置于電熱恒溫培養(yǎng)箱中24h，備用。

      5.6 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基

配制：將上述成分混合后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲于4℃冰箱。

      5.7 鹽溶液(1.65mol/L KCl+0.4mol/L MgCl2)

配制：在水中溶解上述成分后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲于4℃冰箱。

      5.8 0.2mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)

配制：溶解上述成分后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲于4℃冰箱。

      5.9 S9混合液

配制：將輔酶II和6-磷酸葡萄糖置于滅菌三角瓶內(nèi)稱重，然后按上述相反的次序加入各種成分，使肝S9加到已有緩沖液的溶液中。該混合液必須臨用現(xiàn)配，并保存于冰水浴中。實驗結(jié)束，剩余S9混合液應該丟棄。

      5.10 菌株鑒定用和特殊用途試劑

      5.10.1 組氨酸-色氨酸-生物素平板

配制：高壓滅菌瓊脂和水后，將滅菌20%葡萄糖，V-B培養(yǎng)基、組氨酸溶液，加進熱的瓊脂溶液中（若試驗中不使用大腸桿菌，則不添加色氨酸，同時蒸餾水/去離子水改為944mL）。待溶液稍微冷卻后，加入滅菌生物素，混勻，澆制平板。

      5.10.2 氨芐青霉素平板和氨芐青霉素/四環(huán)素平板

配制：瓊脂和水高壓滅菌20min，將無菌的葡萄糖、VB鹽溶液、組氨酸溶液和色氨酸溶液，加進熱的瓊脂溶液中，混勻（若試驗中不使用大腸桿菌，則不添加色氨酸，同時蒸餾水/去離子水改為加940mL）。冷卻至大約50℃，無菌條件下加入四環(huán)素溶液和/或氨芐青霉素溶液。

應該在傾注瓊脂平板后幾天內(nèi)，制備主平板。

      5.10.3 營養(yǎng)瓊脂平板

配制：于0.103MPa下高壓滅菌30min后傾注平板。

      6  試驗菌株及其生物學特性鑒定

      6.1 試驗菌株

采用以下菌株作為標準組合：

鼠傷寒沙門氏菌TA1535；

鼠傷寒沙門氏菌TA97或TA97a或TA1537；

鼠傷寒沙門氏菌TA98；

鼠傷寒沙門氏菌TA100；

鼠傷寒沙門氏菌TA102或大腸桿菌WP2uvrA或大腸桿菌WP2uvrA（pKM101）；

      6.2 生物學特性鑒定

新獲得的或長期保存的菌種，在試驗前必須進行菌株的生物特性鑒定。菌株鑒定的判斷標準，如表1所示。

表1 試驗菌株鑒定的判斷標準

      6.2.1 組氨酸缺陷/色氨酸缺陷

原理：組氨酸缺陷型試驗菌株本身不能合成組氨酸，只能在補充組氨酸的培養(yǎng)基上生長，而在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上，則不能生長。

色氨酸缺陷試驗菌株本身不能合成色氨酸，只能在補充色氨酸的培養(yǎng)基上生長，而在缺乏色氨酸的培養(yǎng)基上，則不能生長。

鑒定方法：將測試菌株增菌液分別于含組氨酸或者色氨酸培養(yǎng)基平板和無組氨酸或者色氨酸平板上劃線，于37℃下培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。

結(jié)果判斷：組氨酸缺陷型菌株在含組氨酸平板上生長，而在無組氨酸平板上則不能生長；色氨酸缺陷型菌株在含色氨酸平板上生長，而在無色氨酸平板上則不能生長。

      6.2.2 脂多糖屏障缺損

原理：具有深粗糙（rfa）的菌株，其表面一層脂多糖屏障缺損，因此一些大分子物質(zhì),如結(jié)晶紫能穿透菌膜進入菌體，從而抑制其生長，而野生型菌株則不受其影響。

鑒定方法：吸取待測菌株增菌液0.1mL于營養(yǎng)瓊脂平板上劃線，然后將浸濕的0.1%結(jié)晶紫溶液濾紙條與劃線處交叉放置。37℃下培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。

結(jié)果判斷：假若待測菌在濾紙條與劃線交叉處出現(xiàn)一透明菌帶，說明該待測菌株具有rfa突變。

      6.2.3 氨芐青霉素抗性

原理：含R因子的試驗菌株對氨芐青霉素有抗性。因為R因子不太穩(wěn)定，容易丟失，故用氨芐青霉素確定該質(zhì)粒存在與否。

鑒定方法：吸取待測菌株增菌液0.1mL，在氨芐青霉素平板上劃線，37℃下培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。

結(jié)果判斷；假若測試菌在氨芐青霉素平板上生長，說明該測試菌具有抗氨芐青霉素作用，表示含R因子，否則，表示測試菌不含R因子或R因子丟失。

      6.2.4 紫外線敏感性

原理：具有△uvrB/A突變的菌株對紫外線敏感，當受到紫外線照射后，不能生長，而具有野生型切除修復酶的菌株，則能照常生長。

鑒定方法：吸取待測菌株增菌液0.1mL于營養(yǎng)瓊脂平板上劃線，用黑紙蓋住平板的一半，置紫外燈下照射（15W，距離33cm）8秒鐘。置37℃下孵育24h后觀察結(jié)果。

結(jié)果判斷：具有△uvrB/A突變的菌株對紫外線敏感，經(jīng)輻射后細菌不生長，而具有完整地切除修復系統(tǒng)的菌株，則照常生長。

      6.2.5 四環(huán)素抗性

原理：具有pAQI的菌株對四環(huán)素有抗性。

鑒定方法：吸取待測菌株增菌液0.1mL于氨芐青霉素/四環(huán)素平板上劃線，置37℃下孵育24h后觀察結(jié)果。

結(jié)果判斷：假若測試菌照常在氨芐青霉素/四環(huán)素平板上生長，表明該測試菌株對氨芐青霉素和四環(huán)素兩者有抗性，具有pAQI質(zhì)粒，否則，說明測試菌株不含pAQI質(zhì)粒。

      6.2.6 自發(fā)回變

原理：每種試驗菌株都以一定的頻率自發(fā)地產(chǎn)生回變，稱為自發(fā)回變。這種自發(fā)回變是每種試驗菌株的一項特性。

鑒定方法：將待測菌株增菌液0.1mL加到2mL含組氨酸-色氨酸-生物素的頂層瓊脂培養(yǎng)基的試管內(nèi)（若試驗中不使用大腸桿菌，則不添加色氨酸），混勻后鋪到于底層瓊脂平板上，待瓊脂固化后，置37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中孵育48—72h后記數(shù)每皿回變菌落數(shù)。

結(jié)果判斷：每種標準測試菌株的自發(fā)回變菌落數(shù)應符合表1要求。經(jīng)體外代謝活化后的自發(fā)回變菌落數(shù)，要比直接作用下的略高。

      6.2.7 回變特性-診斷性試驗

原理：每種試驗菌株對診斷性誘變劑回變作用的性質(zhì)以及S9混合液的效應不一。

鑒定方法：按照平板摻入試驗的操作步驟進行。將受試物換成診斷性誘變劑。

結(jié)果判斷：標準菌株對某些診斷性誘變劑*的回變結(jié)果參見表2。

      表2 測試菌株的回變性

注：inh表示抑菌。

      7  大鼠肝微粒體酶的誘導和S9的制備

      7.1 誘導

選擇健康雄性成年大鼠，體重200g左右。將多氯聯(lián)苯（PCB混合物）溶于玉米油中，濃度為200mg/mL，按500mg/kg體重一次腹腔注射，5d后處死動物，處死前禁食12h。

也可采用C12H12N2O3鈉和β-萘黃酮聯(lián)合誘導的方法進行制備。經(jīng)口或腹腔注射給予80mg/kgC12H12N2O3鈉和80mg/kg β-萘黃酮，連續(xù)3天，處死前禁食16h。

      7.2 S9制備

首先，用75%酒精消毒動物皮毛，剖開腹部。在無菌條件下，取出肝臟，去除肝臟的結(jié)締組織，用冰浴的0.15mol/LKCl溶液淋洗肝臟，放入盛有0.15mol/LKCl溶液的燒杯里。按每克肝臟加入0.15mol/LKCl溶液3mL。用電動勻漿器制成肝勻漿，再在低溫高速離心機上，在4℃條件下，以9000g離心10min，取其上清液（S9）分裝于塑料管中。每管裝2mL—3mL。儲存于液氮生物容器中或－80℃冰箱中備用。

上述全部操作均在冰水浴中和無菌條件下進行。制備肝S9所用一切手術(shù)器械、器皿等，均經(jīng)滅菌消毒。S9制備后，其活力需經(jīng)診斷性誘變劑進行鑒定。

      8  溶劑的選擇

如果受試物為水溶性，可用滅菌蒸餾水/去離子水作為溶劑；如為脂溶性，應選擇對試驗菌株毒性低且無致突變性的有機溶劑，常用的有二甲基亞砜（DMSO）、丙酮、95%乙醇。一般操作中，為了減少誤差和溶劑的影響，常按每皿使用劑量用同一溶劑配成不同的濃度，固定加入量為100μl。

      9  劑量的設(shè)計

決定受試物MAX高劑量的標準是對細菌的毒性及其溶解度。自發(fā)回變數(shù)的減少，背景菌變得清晰或被處理的培養(yǎng)物細菌存活數(shù)減少，都是毒性的標志。

對原料而言，一般MAX高劑量組可為5mg/皿或5µl/皿。對產(chǎn)品而言，有殺菌作用的受試物，MAX高劑量可為MAX低抑菌濃度，無殺菌作用的受試物，MAX高劑量可為原液。受試物至少應設(shè)四個劑量組。每個劑量均做三個平行平板。

      10  試驗操作步驟

      10.1 增菌培養(yǎng)

取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基5mL，加入無菌試管中，將主平板或冷凍保存的菌株培養(yǎng)物接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，37℃振蕩（100次/min）培養(yǎng)10h。該菌株培養(yǎng)物應每毫升不少于1-2×109活菌數(shù)。

      10.2 平板摻入法

實驗時，將含0.5mmol/L組氨酸－0.5mmol/L色氨酸-0.5mmol/L生物素溶液（若試驗中不使用大腸桿菌，則不添加色氨酸）的頂層瓊脂培養(yǎng)基2.0mL分裝于試管中，45℃水浴中保溫，然后每管依次加入試驗菌株增菌液0.1mL，受試物溶液0.1mL和磷酸鹽緩沖液0.5mL或者S9混合液0.5mL（需代謝活化時），充分混勻，迅速傾入底層瓊脂平板上，轉(zhuǎn)動平板，使之分布均勻。水平放置待冷凝固化后，倒置于37℃培養(yǎng)箱里孵育48—72h。記數(shù)每皿回變菌落數(shù)。

實驗中，除設(shè)受試物各劑量組外，還應同時設(shè)空白對照、溶劑對照、陽性誘變劑對照和無菌對照。

      11  數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判斷

記錄受試物各劑量組、空白對照（自發(fā)回變）、溶劑對照以及陽性誘變劑對照的每皿回變菌落數(shù)，并求平均值和標準差。

如果受試物TA1535、TA1537、WP2uvrA的回變菌落數(shù)是溶劑對照回變菌落數(shù)的三倍或三倍以上，受試物TA97、TA97a、TA98、TA100、TA102、WP2uvrA（pKM101）的回變菌落數(shù)是溶劑對照回變菌落數(shù)的二倍或二倍以上，并出現(xiàn)以下情形之一，則該受試物判定為致突變陽性，

（1）呈劑量-反應關(guān)系

（2）任何一個劑量條件下，出現(xiàn)陽性反應并有可重復性

受試物經(jīng)上述五個試驗菌株測定后，只要有一個試驗菌株，無論在加S9或未加S9條件下為陽性，均可報告該受試物細菌回復突變試驗為致突變陽性。如果受試物經(jīng)五個試驗菌株檢測后，無論加S9和未加S9均為陰性，則可報告該受試物為致突變陰性。