許多同學(xué)對細(xì)胞消化做了許多研究，得出了很多有價值的經(jīng)驗，也見到很多人的困惑。其實細(xì)胞培養(yǎng)，尤其是細(xì)胞系的培養(yǎng)，就消化而言，不是太難，做得多了，善于總結(jié)經(jīng)驗，就能把細(xì)胞越養(yǎng)越好。一般的程序步驟，細(xì)節(jié)操作，介紹一些基本操作背后的知識，如果不對之處，歡迎指正，一起討論。
1、其實絕大部分細(xì)胞消化的時候是只要用胰酶潤洗一遍即可，吸去胰酶后，殘留的那些無法計算體積的附著在細(xì)胞表面的微量胰酶在37度一般不到2min足夠消化細(xì)胞（絕大部分1min不到）。對于這些細(xì)胞原則上不要用胰酶孵育細(xì)胞，連續(xù)這樣傳代，對細(xì)胞傷害很大。簡單的程序是PBS潤洗吸去，胰酶潤洗吸去，然后電熱恒溫培養(yǎng)箱37度消化。
2、什么算是消化好了呢？不是細(xì)胞全部成間隔分布很離散的單個圓形才算消化好了，一般你肉眼觀察貼壁細(xì)胞層，只要能移動了，多半呈沙壯移動，其實已經(jīng)可以了。一般能移動了，說明細(xì)胞與培養(yǎng)基質(zhì)材料的附著已經(jīng)消失了，細(xì)胞之間的附著也已經(jīng)消失了，細(xì)胞已經(jīng)獨立分布了（雖然沒有呈現(xiàn)很廣的離散分布）。這個時候應(yīng)該停止消化，不要等到看到鏡下所有細(xì)胞都分離得非常好，間隙很大，才停止。細(xì)胞就是*成單個細(xì)胞懸液，之后在貼壁的過程中仍然會聚集，這個是貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞，尤其是腫瘤細(xì)胞的一個特性。
3、細(xì)胞只要能從基質(zhì)上脫離下來，這個時候即使是成片的（比如Calu-3細(xì)胞），吹打不超過20次后（一般10次即可），成小規(guī)模聚集（10個細(xì)胞左右），是正常的，不要試圖再去延長消化時間。不要以為成片分布是自己沒養(yǎng)好，這個視細(xì)胞而定。如果和標(biāo)準(zhǔn)形態(tài)不一致，那可能是自己沒消化好導(dǎo)致的，但如果消化方法正確，仍然成片分布，甚至*吹打成單細(xì)胞懸液，貼壁后仍然成片分布，這是細(xì)胞的特性，是因為貼壁過程中重新聚集了。
4、比較難消化的細(xì)胞（潤洗方法5min還不能消化），就以colon cancer為例，比如HCT15, LS411和KM12，這樣的細(xì)胞一般需要用少量胰酶孵育，但也不需要很多，一般100 mm dish，一次MAX多加入500ul，就足夠了。即使這樣難消化的細(xì)胞，一般不超過5min，即可見細(xì)胞成片移動，就應(yīng)該停止消化。一些正常細(xì)胞也會有難消化的時候，比如tsDC細(xì)胞，但也只要用少量胰酶孵育，3min左右即可看到成片沙狀移動。
5、消化時間和細(xì)胞類型、消化液的消化能力、細(xì)胞的密度等多種因素有關(guān)。一般養(yǎng)一種新的細(xì)胞要摸索一下消化時間，掌握細(xì)胞消化到什么程度恰到好處。新配的消化液消化能力較強，配好后可分裝成小管，一次用完，其余凍在-20℃低溫保存箱內(nèi)，以保持酶活力。細(xì)胞生長到覆蓋70～80％瓶底時消化較好，若細(xì)胞密度過大則消化后細(xì)胞易成團。
6、常規(guī)的細(xì)胞實驗（增殖，凋亡，遷移，分化之類的），如果不用胰酶去孵育而使用潤洗的方法消化的話（難消化細(xì)胞例外），受消化影響不是很大。但少數(shù)實驗，比如病毒包裝，對細(xì)胞代數(shù)，對細(xì)胞狀態(tài)要求*。這個時候，胰酶消化，就是潤洗，都會對細(xì)胞包裝病毒的能力有影響，傳代次數(shù)一多，細(xì)胞包裝能力就會逐漸下降（當(dāng)然也有其它因素影響包裝效率）。這個時候都不用胰酶消化，用一些鹽溶液（不是EDTA液）即可。這些鹽溶液通過影響ECM相關(guān)酶的活性，來使得細(xì)胞脫離基質(zhì)附著表面，但不切割任何蛋白。
7、PBS洗滌。消化之前用PBS洗滌，是常見的操作，因為Serum含有抑制trypsin的蛋白。但這里面也有學(xué)問可以講，對于一些難消化細(xì)胞，那么可以配制不含Ca，Mg離子的PBS，因為這些離子也會抑制trypsin的活性。但對于絕大部分胰酶或者EDTA溶液潤洗即可消化的細(xì)胞，不需要配制如此溶液。
