細(xì)胞傳代培養(yǎng)的基本原理?

        生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中常常會(huì)用到細(xì)胞系，因?yàn)樗鼈兛梢钥焖偕L(zhǎng)和擴(kuò)增提供實(shí)驗(yàn)分析要用到的細(xì)胞，而細(xì)胞培養(yǎng)箱恰恰能提供培養(yǎng)所需的環(huán)境。細(xì)胞系與新分離的或原代細(xì)胞的培養(yǎng)條件相類似，但也有一些基本不同的地方：

        （1）每個(gè)細(xì)胞系需要其特定的生長(zhǎng)因子混合物。

        （2）與原代細(xì)胞相比，它們的生長(zhǎng)需要更嚴(yán)密的監(jiān)測(cè)，因?yàn)槭顾鼈儫o(wú)限生長(zhǎng)的突變同時(shí)也會(huì)造成它們很快達(dá)到過(guò)度生長(zhǎng)。因此，當(dāng)細(xì)胞系生長(zhǎng)到了幾乎覆蓋整個(gè)培養(yǎng)器皿底部，也就是90%的密度時(shí)，細(xì)胞需要重懸洗滌用于實(shí)驗(yàn)或凍存以備將來(lái)使用，或者重新接種到新的培養(yǎng)器皿進(jìn)一步擴(kuò)增。

        細(xì)胞傳代或續(xù)代培養(yǎng)是將細(xì)胞從現(xiàn)有的培養(yǎng)物分開或分出來(lái)開始新的培養(yǎng)，并加入新鮮培養(yǎng)液來(lái)促進(jìn)擴(kuò)增的常用手段。盡管它的概念本身相對(duì)簡(jiǎn)單，本短文中喆圖小編將分享能成功保存和擴(kuò)增細(xì)胞系的一些更重要的步驟。

        細(xì)胞傳代的基本原則



        代謝的有毒物質(zhì)會(huì)隨時(shí)間在細(xì)胞培養(yǎng)液中累積。當(dāng)擴(kuò)增細(xì)胞時(shí)，尤為重要的是經(jīng)常更換培養(yǎng)液以維持細(xì)胞健康和監(jiān)測(cè)細(xì)胞擴(kuò)增情況以避免細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)度。



        傳代的細(xì)胞通常分為三個(gè)主要類型：腫瘤細(xì)胞系、永生化細(xì)胞系、干細(xì)胞系。



        永生化細(xì)胞系是那些來(lái)自多細(xì)胞生物的細(xì)胞通過(guò)一些突變修飾改變了細(xì)胞周期調(diào)控從而可以無(wú)限繁殖的細(xì)胞。



        與腫瘤永生化的細(xì)胞系相反，干細(xì)胞系通常從成人和胚胎組織的可自我更新的多能細(xì)胞中分離得到。這些細(xì)胞, 如您在短片中看到的人類胚胎干細(xì)胞 , 在適當(dāng)?shù)臈l件下也能無(wú)限傳代培養(yǎng)。



        細(xì)胞在優(yōu)化條件下可以懸浮培養(yǎng)，如從血液中分離到的永生化細(xì)胞, 或者貼壁培養(yǎng)，如許多從組織中分離的細(xì)胞系。



        貼壁細(xì)胞的生長(zhǎng)必須仔細(xì)監(jiān)測(cè)以確保細(xì)胞保持健康。根據(jù)細(xì)胞類型，很多貼壁細(xì)胞在其達(dá)到70-90%密度，也就是覆蓋了培養(yǎng)容器表面的70-90%時(shí)需要傳代。



        要謹(jǐn)記，這些細(xì)胞系雖然保留了原細(xì)胞源的很多特征，但是每次傳代也會(huì)使它們開始產(chǎn)生一些擴(kuò)增細(xì)胞的*特性。因此，對(duì)任何一個(gè)特定細(xì)胞系，要考慮限制傳代的次數(shù)。





        細(xì)胞傳代常用的儀器和試劑



        傳代細(xì)胞時(shí)，使用無(wú)菌技術(shù)和合適的試劑及設(shè)備尤為重要。



        針對(duì)您的細(xì)胞系選擇合適的培養(yǎng)液來(lái)得到適宜的生長(zhǎng)和擴(kuò)增很關(guān)鍵。每一個(gè)細(xì)胞系都有特定的生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)組分配方，但是大多數(shù)細(xì)胞系起碼需要的添加物有以下這些：血清，如胎牛血清，需熱處理滅活其胎牛成分，它為細(xì)胞生長(zhǎng)提供重要的生長(zhǎng)因子?？股兀缜嗝顾睾玩溍顾赜糜诜乐辜?xì)胞污染。其他的生長(zhǎng)因子，如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，有助于延長(zhǎng)細(xì)胞系的生長(zhǎng)和擴(kuò)增。不使用時(shí)，要將這些添加物或者“*”細(xì)胞培養(yǎng)液保存于4攝氏度。



        首先要注意細(xì)胞培養(yǎng)液的顏色，富含營(yíng)養(yǎng)的新鮮培養(yǎng)液由于添加了pH指示劑酚紅故為透明橙色。當(dāng)細(xì)胞耗盡培養(yǎng)液中的營(yíng)養(yǎng)成分時(shí)，開始在培養(yǎng)物中積累廢物和酸性物質(zhì)，降低pH值。因此，許多細(xì)胞培養(yǎng)液含有酚紅，當(dāng)培養(yǎng)物呈酸性時(shí)會(huì)將培養(yǎng)液顏色由橙色變?yōu)辄S色。培養(yǎng)液需在變黃之前更換。當(dāng)酚紅變?yōu)榉奂t色時(shí)，說(shuō)明培養(yǎng)基pH偏堿，不利于細(xì)胞健康生長(zhǎng)。這時(shí)可能需要改變二氧化碳濃度并更換培養(yǎng)液。



        很多貼壁細(xì)胞系可天然附著于無(wú)涂層的塑料上。因此，塑料細(xì)胞培養(yǎng)板如培養(yǎng)皿或六孔板經(jīng)常用于傳代細(xì)胞。塑料的細(xì)胞培養(yǎng)瓶也經(jīng)常用到，如T25的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，常用于擴(kuò)增培養(yǎng)數(shù)目少的細(xì)胞或者開始培養(yǎng)生長(zhǎng)緩慢的細(xì)胞系。T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶常用在培養(yǎng)擴(kuò)增速度較快的細(xì)胞系或用于生長(zhǎng)超過(guò)T25培養(yǎng)瓶容量的大量細(xì)胞。



        在轉(zhuǎn)移貼壁細(xì)胞時(shí)，要先剪切掉細(xì)胞上與和塑料結(jié)合的蛋白。因此，消化酶胰酶常用于消化細(xì)胞?？刂埔让赶臅r(shí)間很重要，因?yàn)槿绻幚頃r(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)損壞細(xì)胞表面的蛋白。細(xì)胞培養(yǎng)液能中和胰酶。所以在胰酶消化前常用磷酸緩沖液或PBS洗滌細(xì)胞。EDTA，一種鈣螯合劑有時(shí)候也用于提高胰酶的蛋白水解功能。



        為擴(kuò)增細(xì)胞克隆，將新鮮傳代的細(xì)胞培養(yǎng)于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，選擇適合該細(xì)胞生長(zhǎng)條件，通常為溫度37度，二氧化碳5％和濕度95%。



        如何傳代細(xì)胞

        首先，重要的是要清楚細(xì)胞需要監(jiān)測(cè)的頻繁程度，這取決于該細(xì)胞的擴(kuò)增速度。



        現(xiàn)在培養(yǎng)液為亮橙色，再觀察其它生長(zhǎng)情況。如培養(yǎng)液是否渾濁-如渾濁則可能有污染, 細(xì)胞的大小和密度以及細(xì)胞的總體質(zhì)量。



        如果細(xì)胞密度達(dá)到90%，吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，用無(wú)鈣離子和鎂離子的磷酸緩沖液洗滌。



        然后加入胰酶，置于37攝氏度約5分鐘，確認(rèn)細(xì)胞脫壁后，加入新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液終止胰酶的水解。



        將懸浮的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到錐形管離心。細(xì)胞離心下來(lái)后，小心棄去上清，重懸細(xì)胞于新鮮培養(yǎng)液。計(jì)數(shù)收集到的細(xì)胞然后根據(jù)合適密度接種細(xì)胞立即進(jìn)行擴(kuò)增或用于將來(lái)擴(kuò)增。



        變化和應(yīng)用

        現(xiàn)在您知道了如何傳代細(xì)胞，讓我們?cè)賮?lái)看看傳代的一些不同應(yīng)用。



        前面已經(jīng)提到，人胚胎干細(xì)胞是一類必須傳代的細(xì)胞。它們通常與小鼠成纖維細(xì)胞MEF共培養(yǎng)，后者能提供幫助干細(xì)胞保持其多能性的因子。



        生長(zhǎng)于飼養(yǎng)細(xì)胞上的干細(xì)胞到了合適的發(fā)育階段時(shí)需挑出來(lái)。可用微型移液管挑出或用玻璃工具輕輕將其刮下然后接種于新的培養(yǎng)液中進(jìn)行擴(kuò)增。



        有一些細(xì)胞系對(duì)酶消化敏感，或者貼壁很緊無(wú)法使用胰酶處理來(lái)重懸。細(xì)胞刮常用來(lái)輕輕將細(xì)胞從培養(yǎng)板的底部刮下來(lái)。如果細(xì)胞貼壁特別緊，可加入培養(yǎng)液或適當(dāng)溶液后用血清吸管用力刮擦。使用該方法時(shí)要小心，細(xì)胞比較脆弱，容易在這種機(jī)械剝離的方法中受損。



        為了更快并可重復(fù)性的大量擴(kuò)增細(xì)胞到超過(guò)單層培養(yǎng)瓶容量的規(guī)模，可以使用容量大一些的細(xì)胞培養(yǎng)箱，它的培養(yǎng)量可達(dá)單層培養(yǎng)瓶的30-50倍。