如何用人工氣候培養(yǎng)箱制備重癥中暑小鼠模型

重癥中暑（severe heat stroke）是一種危及生命的熱致性疾病，可繼發(fā)全身炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征，具有高病死率和高致殘率的特點(diǎn)。腸屏障是抵抗病原微生物的第一道屏障，重癥中暑繼發(fā)的腸黏膜損傷破壞了腸屏障功能，是驅(qū)動(dòng)內(nèi)毒素血癥、全身炎癥反應(yīng)及多器官功能障礙綜合征發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素。然而，重癥中暑導(dǎo)致腸黏膜損傷的分子機(jī)制仍未明確。當(dāng)各種應(yīng)激因素破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)誘導(dǎo)未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白累積時(shí)，可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的初衷是恢復(fù)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，若損傷過(guò)重導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過(guò)于強(qiáng)烈或持久則可激活細(xì)胞死亡途徑。腸黏膜上皮具有豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)，處理內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的能力是決定腸道保持穩(wěn)態(tài)抑或是發(fā)生病變的重要因素。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了炎癥性腸病、腸道腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。NOD樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）是NOD樣受體家族的重要成員，與接頭蛋白和效應(yīng)分子結(jié)合形成炎癥小體參與宿主的免疫應(yīng)答和多種疾病的病理生理過(guò)程。新近研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激能激活NLRP3炎癥小體介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，而炎癥反應(yīng)是重癥中暑繼發(fā)組織損傷的重要病理改變。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和NLRP3炎癥小體活化是否參與了重癥中暑導(dǎo)致的腸黏膜損傷目前鮮見(jiàn)報(bào)道。4-苯基丁酸（4-phenylbutyric acid，4-PBA）作為一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑，可穩(wěn)定肽鏈結(jié)構(gòu)，加強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊能力并清除錯(cuò)誤折疊蛋白。4-PBA現(xiàn)已用于臨床治療尿素循環(huán)障礙和鐮狀細(xì)胞病，并在多種疾病尤其是炎癥性疾病的治療中顯示出潛在的應(yīng)用前景。在膿毒癥休克大鼠模型中，4-PBA通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激，保護(hù)重要臟器的功能。還有研究表明，4-PBA可通過(guò)調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞中的自噬防止脂多糖引起的炎癥性骨質(zhì)流失。

      本研究通過(guò)制備HS小鼠模型，觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和NLRP3炎癥小體的活化情況，使用4-PBA預(yù)處理抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而反向驗(yàn)證內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在HS腸黏膜損傷中的作用，并觀察4-PBA對(duì)HS腸黏膜損傷是否具有保護(hù)作用。

      實(shí)驗(yàn)前小鼠于明暗交替（12h光照/黑暗循環(huán)）的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，環(huán)境溫度為（25.0±0.5）℃，環(huán)境濕度為（35.0±5.0）%，并允許其隨意飲水和進(jìn)食。小鼠隨機(jī)（隨機(jī)數(shù)字表法）分為對(duì)照（control）組、HS組和4-PBA預(yù)處理組（4-PBA+HS）。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后，將HS組和4-PBA+HS組小鼠置于預(yù)熱的高溫人工氣候培養(yǎng)箱中，溫度保持于（35.5±0.5）℃，濕度保持于（60.0±5.0）%。4-PBA預(yù)處理組的小鼠在接受熱暴露之前予以腹腔注射4-PBA 120 mg/kg 。而對(duì)照組的小鼠保持在環(huán)境溫度為（25.0±0.5）℃，濕度為（35.0±5.0）%。用直腸溫度計(jì)連續(xù)監(jiān)測(cè)直腸核心溫度（Tc）。前期的研究表明，當(dāng)小鼠Tc達(dá)到42℃時(shí)，即成功建立了HS小鼠模型。在Tc達(dá)到42℃后，小鼠接受復(fù)溫處理。復(fù)溫策略如下：將小鼠從高溫人工氣候培養(yǎng)箱中取出并在環(huán)境溫度（25.0±0.5）℃和濕度（35.0±5.0）%的條件下冷卻，允許小鼠自由飲水。前期的研究表明，HS小鼠的器官損傷程度隨著復(fù)溫時(shí)間的延長(zhǎng)而加重，其平均存活時(shí)間約為造模成功后6h。因此，本實(shí)驗(yàn)的后續(xù)檢測(cè)選擇了該時(shí)間點(diǎn)。在復(fù)溫處理6h后，通過(guò)頸椎脫位處死所有小鼠，收集血清，采集回腸組織，用4 ℃ PBS沖洗，并儲(chǔ)存于-80 ℃用于進(jìn)一步研究。