乳酸脫氫酶（LDH）釋放法

1）測(cè)定方法

1．用含5％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液將靶細(xì)胞調(diào)整到5×104～2×105/ml，此濃度需根據(jù)情況預(yù)先標(biāo)定。

2．在96孔圓底細(xì)胞培養(yǎng)板中加入靶細(xì)胞，每孔加100μl。3個(gè)效應(yīng)細(xì)胞自然釋放對(duì)照孔不加靶細(xì)胞，只加100μl培養(yǎng)液。

3．向各孔加100μl效應(yīng)細(xì)胞，效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比例根據(jù)要求而定，通常為5：1～20：1。自然釋放孔不加效應(yīng)細(xì)胞只加100μl培養(yǎng)液，最大釋放孔中加100μl 1％ NP40。每個(gè)實(shí)驗(yàn)置三個(gè)復(fù)孔。

4．置37℃ 5％ CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6小時(shí)。

5．離心培養(yǎng)板200×g 10分鐘。每孔吸出150μl上清液，對(duì)應(yīng)加入另一塊96孔酶聯(lián)檢測(cè)板中。向第二塊板每孔依次加20μl 0.4mol/L乳酸溶液、20μl 4mmol/L 2-p-碘苯酯-3-p-氯化硝基苯四唑，20μl反應(yīng)液（含0.03％ BSA，2.7U/ml硫辛酰胺脫氫酶，4.5mmol/L氫化型輔酶I（NAD＋），1.2％蔗糖的PBS），室溫中放置20分鐘。

6．在酶聯(lián)檢測(cè)儀上測(cè)定各孔的光密度（OD值），檢測(cè)波長(zhǎng)492nm，參考波長(zhǎng)650nm。

2）特異性殺傷活性的計(jì)算

殺傷活性（％）＝[（OD實(shí)驗(yàn)組－OD總自然釋放）/（OD最大釋放組－OD總自然釋放）]×100％